【檢驗原理】本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù)，設計一對馬源性成分(Horse)保守區(qū)特異性引物結(jié)合一條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對馬源性成分(Horse)保守區(qū)的DNA進行體外擴增檢測，從而達到快速檢測之目的。

轉(zhuǎn)基因水稻LLRICE62試劑盒(熒光-PCR法)【試劑組成】

注：

1） 不同批號試劑不能混用。

2） 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次。有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycle、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】取動物組織及其制品、食品或飼料約 1g。

【保存和運輸】上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃。但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2-8℃冰袋運輸

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

取動物組織及其制品、食品或飼料約 1g，剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2 核酸提取

1.3 提取采用提取或試劑（磁珠法或離心柱法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 10份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

5. 結(jié)果分析判定

• 結(jié)果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2 判斷

a) 檢測通道 Ct 值≤35，有 FAM 熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，判斷樣品為陽性。

b) 當 30<Ct 值≤35 時，且有典型的擴增曲線時，則需重復實驗。再次擴增后檢測體系的Ct 值仍≤35，且有典型的擴增曲線，則判定該樣品含有相應的動物源性成分。當再次擴增后，檢測體系 Ct 值＞35，或無典型的擴增曲線，則判定該樣品不含相應的動物源性成分。

6. 質(zhì)控標準

a) 空白對照：無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35，未出現(xiàn)典型的擴增曲線。

b) 陰性對照：無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35，未出現(xiàn)典型的擴增曲線。

c) 陽性對照：有 FAM 熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct 值＜30。

d) 以上應同時滿足，否則本次實驗無效。

轉(zhuǎn)基因水稻LLRICE62試劑盒(熒光-PCR法)【注意事項】

? 所有操作嚴格按照說明書進行；檢驗過程中，參照《GB/T 27403 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品分子生物學檢測》的規(guī)定進行。

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，混勻并短暫離心；

? 反應液應避光保存；

? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

? 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全   通則》進行處理。

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滬崢PCR優(yōu)勢：

   1.   特異性：所有產(chǎn)品使用的引物均經(jīng)過詳盡的生物信息學分析，經(jīng)過GenBank及自建龐大數(shù)據(jù)庫的比對，確保
所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區(qū)段，可實現(xiàn)對細菌種屬及血清型的特異檢測。

   2.   重現(xiàn)性：該系列所有產(chǎn)品均經(jīng)過大量實驗菌株的驗證。

   3.   靈敏性：該系列產(chǎn)品可實現(xiàn)對檢測菌的高靈敏檢測，當樣品中細菌的濃度達到103cfu/ml時，可實現(xiàn)對其的直接檢測，無需繁瑣的增菌過程。

   4.   實用性：檢測范圍廣，涵蓋了對人體危害較為嚴重的17種呼吸道及腸道致病菌，可實現(xiàn)對臨床樣品及其他環(huán)境取樣的快速檢測，整個檢測過程為3-4個小時。

P CR實驗概述